摘要:
抗体药物常呈现微观不均一性，即“异质性”，包括糖基化、电荷、相对分子质量大小等相关的异构体。这些异构体绝大部分来自于“细胞工厂”对重组蛋白的翻译后修饰作用，如聚体、降解、糖基化修饰、氧化、脱酰基化、二硫键错配等。这些修饰不仅对抗体的质量、安全性和有效性均可能造成影响，而且也是整个抗体生产工艺的重要指征。本文对抗体糖基化、电荷及相对分子质量大小等异质性与药物有效性、安全性、药代动力学及免疫原性等的联系进行综述，有助于进一步认识抗体结构与功能关系，并希望为抗体药物尤其是生物类似药物的开发提供一定的依据和指导。
一前言
目前生物药物应用日趋广泛，特别是抗体药物，以其靶点明确、不良反应小、作用效果明显等优点，占据了当代生物药物产业的主导地位。随着众多重磅炸弹级生物药物的专利保护陆续到期，国内外都掀起了生物类似药的研发热潮。
然而，与小分子药物相比，生物大分子的单克隆抗体的结构要复杂得多，这无疑为生物类似药的研发及临床应用带来了挑战。抗体药物常呈现微观不均一性，即“异质性”，糖基化、电荷、相对分子质量大小、形态等相关的异构体。这些异构体绝大部分来自于“细胞工厂”对重组蛋白的翻译后修饰作用，如聚体、降解、糖基化修饰、氧化、脱酰基化、二硫键错配等。这些修饰不仅对抗体的质量、安全性和有效性可能造成影响，而且也是整个生产工艺的重要指征。随着质量源于设计(qualitybydesign，QbD)理念逐步在生物制药产业的深入，对异构体分离并进行性质鉴定已成为生物药物生产过程设计时必须考虑的因素。关键质量属性(criticalqualityattributes，CQAs)的确立也有赖于这些异构体对于药物活性、安全性等方面的信息。本文对抗体异质性与药物有效性、安全性、药代动力学及免疫原性等的联系进行综述，有助于进一步认识抗体结构与功能关系，并希望为抗体药物尤其是生物类似药物的开发提供一定的依据和指导。
单克隆抗体是由两条重链和两条轻链通过共价键和非共价键联合形成的生物大分子，每条链又由可变区和恒定区构成。同时，抗体可经木瓜蛋白酶水解为Fc和Fab片段。治疗性抗体在体内的生理活性主要由两个机制介导:一是引起靶标抗原中和或者凋亡的作用，主要通过Fab段识别并特异性结合抗原物质，抑制或者促进信号传导或者介导凋亡作用，该生理活性的作用依赖于抗体可变区与抗原的亲和力;二是抗体的免疫效应，主要包括抗体依赖性细胞介导的细胞*作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC)和补体依赖性细胞介导的细胞*作用(CDC)，抗体Fc段具有细胞*作用效应细胞配体结合位点，可分别与NK细胞表面表达的FcγＲⅢa和补体级联反应的补体C1q组分相结合，介导ADCC和CDC作用。因而，抗体Fab段的修饰会影响抗体抗原的亲和力，从而改变抗体的中和效应;而抗体Fc段的修饰也会对抗体的ADCC和CDC效应造成影响。
二糖基化异质性
蛋白质的糖基化以附连于天冬酰胺(N-连接)或丝氨酸/苏氨酸(O-连接)侧链的寡糖形式发生，其中前者是最主要的糖基化形式。研究表明，上市抗体均在其Fc段具有一个保守的N-糖基化修饰位点Asn，大部分该位点修饰的聚糖为二分支双触角结构。由于具有不同的末端糖残基，如半乳糖、岩藻糖、甘露糖或唾液酸等，使抗体呈现出高度的异质性。根据分支糖链上半乳糖(G)的数量和连接方式以及是否具有岩藻糖(F)等可分为G0F，G1F，G2F等多种糖基化类型。目前美国和欧盟批准上市的大多数抗体均以CHO或SP2/0细胞(或NS0细胞)作为生产表达系统。虽然早期研究表明，哺乳细胞生产的抗体糖型与人类血清抗体基本相似，但仍然存在着一些差别:例如CHO细胞产生抗体存在着少量人体血清抗体所不具备的高甘露糖型修饰;鼠SP2/0细胞(或NS0细胞)生产的抗体具有少量的人体所不存在的半乳糖-α-1，3-半乳糖修饰。同时CHO细胞与鼠源细胞生产过程中产生的糖基化修饰也有所不同:鼠SP2/0细胞(或NS0细胞)具有与CHO细胞不同的唾液酸修饰，以N-羟乙酰基神经氨酸代替了人体中常见的N-乙酰基神经氨酸;此外，CHO细胞生产抗体的半乳糖修饰水平更低，存在更多的G0F糖型。这些糖基化修饰差异对抗体药物的体内活性、代谢及免疫原性等都会造成显著的影响。此外研究表明，人血清中15%～25%的IgGFab段也存在N-糖基化修饰，糖基化位点集中分布于重链或轻链的CDＲ区及骨架。与Fc段糖基化不同的是，Fab段糖基化发生高度唾液酸化及半乳糖基化的概率更高，且Fab段高甘露糖结构也常有报道。一些重组抗体如西妥昔单抗在重链可变区Asn99存在FabN-糖基化，该位点糖基化由于相对抗原结合位点具有较大的空间位阻，可能会严重影响抗体与抗原结合的亲和力。
2.1半乳糖修饰半乳糖修饰对于抗体的CDC作用具有重要影响。研究表明，去除治疗性抗体Campath-1HCH2区域的半乳糖残基，在不改变ADCC活性的同时降低了其CDC活性。同时又有报道指出，体外完全去除利妥昔Fc段Asn位的半乳糖残基，其CDC活性出现明显降低;然而体外添加完全半乳糖修饰，其CDC活性同样也出现了一定的下降:推测中等程度的末端半乳糖基化修饰对于抗体Fc段与C1q的结合是必需且最理想的，而过量的半乳糖修饰反而具有抑制效果。由此得出结论，若抗体药物的活性机制是以其CDC效应为基础，例如在利妥昔生物类似药的开发中，需要严格控制Fc段半乳糖修饰的水平。迄今为止，还缺少抗体药物Fc段半乳糖修饰对安全性方面的直接关联数据，因此对于并非依靠CDC效应发挥主要活性的抗体药物，可以适当放宽对半乳糖修饰的控制。抗体的半乳糖修饰对于其免疫原性也有重要影响:不同于CHO细胞，鼠源SP2/0细胞产生的抗体多存在半乳糖-α-1，3-半乳糖修饰，而人体循环中有1%针对半乳糖-α-1，3-半乳糖的IgE抗体，因此具有该糖链结构的抗体易引发过敏反应。研究发现，美国部分区域使用来源于鼠源SP2/0细胞的西妥昔单抗治疗结直肠癌，具有极高的超敏反应发生率。同时由于半乳糖-α-1，3-半乳糖修饰所引发的严重免疫原性，治疗性抗体的循环半衰期也会随之降低。
2.2岩藻糖修饰和平分型GlcNAc修饰超过90%的CHO细胞生产抗体都存在岩藻糖修饰。核心岩藻糖对于抗体的ADCC效应影响重大，去除核心岩藻糖的抗体与FcγＲⅢa有着很强的结合能力从而能明显提高ADCC效应，同时CDC活性不受岩藻糖的影响。平分型N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)修饰是糖蛋白N-聚糖核心的常见分支修饰形式，哺乳类动物细胞GlcNAc可由-1，4-GlcNAc转移酶Ⅲ(GnT-III)催化形成平分型GlcNAc。高表达GnT-Ⅲ可以抑制哺乳类细胞N-聚糖核心结构的-1，6岩藻糖基化修饰，从而有效提高抗体的ADCC效应。
2.3高甘露糖修饰工程细胞产生抗体存在着少量人体血清抗体所不具备的高甘露糖型修饰。试验表明具有高甘露糖结构的抗体在体内可与肝脏中甘露糖受体结合，加快抗体的血清清除速率，显著降低抗体的半衰期。Alessandri等实验证明高甘露糖修饰抗体的血浆清除速率比岩藻糖修饰组快40%，并指出抗体药物质量研究中应该对这种高甘露糖型进行重点检测，其存在及其比例可能会对抗体的药代研究产生重要影响。而Millward等研究却发现，高甘露糖基化抗体的半衰期与其他复杂聚糖修抗体药物半衰期的作用，可能需要根据抗体的具体属性来确定。此外，高甘露糖结构也影响抗体药物的活性。类似于岩藻糖缺失抗体，具有高甘露糖结构的抗体与FcＲⅢa有着很强的结合能力从而能明显提高ADCC活性。当然，其对ADCC活性的作用可能得益于这种甘露糖结构在核心区域同样不具有岩藻糖修饰的缘故。同时，报道指出，抗体药物中存在的高甘露糖残基降低了抗体与C1q的结合能力，从而使得CDC活性明显下降。
2.4唾液酸修饰血清中抗体Fc段常常存在多种多样的唾液酸修饰，研究结果表明抗体的唾液酸化可以提高抗体的抗炎能力，同时通过下调抗体与FcＲⅢa的亲和力，降低其ADCC活性。此外研究发现，随着唾液酸修饰程度的增加，抗体的血清半衰期也随之升高［3］。在哺乳动物表达系统产生的生物制剂中发现的唾液酸残基具有两种主要类型:N-乙酰基神经氨酸(NeuAc，NANA)和N-羟乙酰基神经氨酸(NeuGc，NGNA)。考虑到鼠SP2/0细胞(或NS0细胞)生产的抗体具有与人体血清中不同的NGNA唾液酸修饰，且已有关于NGNA在人体内的免疫原性报道［7］，控制NeuAc∶NeuGc比率对于生物产品生产商来说至关重要的。但是，从实际情况来说大多数NS0生产抗体仅在Fc段存在极少的NGNA修饰(1%～2%)。因此，上市的NS0或SP2/0抗体(例如年首次批准上市的帕利珠单抗)，并未见与此糖型相关的严重不良事件报道。
三电荷异质性
在工程细胞表达过程中发生的多种翻译后修饰都会引起单克隆抗体的电荷异质性。采用离子交换色谱方法可将抗体大致分成3组峰，以阳离子交换色谱为例，中间峰为主峰，在主峰之前洗脱出峰的为酸性变异体峰，在主峰之后洗脱出峰的为碱性变异体峰。其酸性峰来源于唾液酸化、脱酰胺、糖化、片段化抗体等，而其中对于SP2/0或NS0细胞所表达的单抗而言主要为唾液酸化修饰;碱性峰则来源于C末端赖氨酸的不均一性、氧化、异构化、琥珀酰胺化等，其中主要为C末端赖氨酸的不均一性。抗体的这种电荷异质性会影响抗体的稳定性、有效性、免疫原性或药代动力学，因此，在抗体药物工艺开发中，表面电荷不均一性检测作为质量考察的一个重要指标。
3.1Asn脱酰胺和Asp异构化Asn脱酰胺和Asp异构化是抗体药物降解的主要原因，可直接影响抗体的体外稳定性、体内生物活性以及生物利用度等。Asn脱酰胺后会生成琥珀酰亚胺，后者水解后生成Asp和IsoAsp的混合物。在治疗性抗体生产和储存过程中，抗体的可变区，尤其是CDＲ区或者恒定区都可能存在脱酰胺反应。CDＲ区域的脱酰胺直接影响到抗体和抗原的亲和力。赫赛汀是一种用于治疗HEＲ2+早期乳腺癌以及转移性胃癌的重组人IgG1抗体。近年来，针对赫赛汀的研究发现了一系列脱酰胺和异构化位点，其中HC-Asp位的异构化作用极大的降低了药物的活性作用。同时研究发现Fc片段具有一个保守的脱酰胺位点Asn，考虑到该残基位于CH3结构域，远离FcＲn以及FcＲ结合位点，因而在此处发生的脱酰胺反应并不改变抗体相应的效应功能及循环半衰期。琥珀酰亚胺是Asn脱酰胺和Asp异构化反应的中间体。多项研究证实，CDＲ区琥珀酰亚胺的形成同样影响了抗体抗原的结合能力以及其效价。
3.2糖化作用糖化作用是葡萄糖或乳糖通过共价作用与抗体赖氨酸残基或N-端残基中的NH2基团连接的一种修饰形式。Yuk等研究发现，在细胞培养过程中，较高的葡萄糖浓度可能会增加抗体的糖化程度。糖化反应可能会影响蛋白的生物学活性以及PK等参数，然而由于糖化作用发生于整个抗体分子，没有潜在糖化位点，因此发生糖化而导致的质量问题比较少见。同时Quan等研究证实发生在抗体重链CDＲ区域的糖化反应并不影响其与抗原的结合能力。另一项研究也表明，高度糖化的IgG1或IgG2抗体与非糖化的抗体相比与FcＲⅢa和FcＲn具有相当的亲和力。由于人血清中普遍存在一定的葡萄糖，导致大部分人血浆蛋白均存在10%～20%的糖化反应，因而糖化反应一般不会对免疫原性及安全性造成影响。
3.3重链C-末端赖氨酸的去除IgG1抗体重链的C末端常常具有赖氨酸(K)残基，而胞内的羧肽酶(CBP)可以特异性去除C-末端的碱性氨基酸，但这种酶解往往不完全，因此抗体中往往呈现出多种脱赖氨酸的异构体(0K，1K和2K)。这种C-赖氨酸的不完全去除是抗体碱性变异峰的主要组成部分，通过对羧肽酶消化前后抗体色谱行为的比较可以有效阐明C-赖氨酸占碱性组分的比重。迄今为止的研究表明赖氨酸去除不影响抗体与抗原的结合、Fc段介导的效应功能、抗体的半衰期以及其他生物学作用。同时DSC研究也证实C-末端的赖氨酸缺失与否并不影响IgG1抗体的热力学稳定性。
3.4N-焦谷氨酸化作用抗体轻链和/或重链的N端谷氨酰胺可不完全环合成焦谷氨酸。由于抗体的N端和C端并不具有与抗原或效应功能受体的结合位点，抗体的N端和C端发生的修饰并不影响抗体的结构、稳定性或者活性。研究发现，两条重链都具有N-谷氨酰胺的抗体与只具有1个N-谷氨酰胺的抗体生物活性方面并不具有差异性。
3.5氧化作用氧化作用也是一种常见的蛋白翻译后修饰，通常发生在蛋氨酸、色氨酸位点。其中蛋氨酸氧化在细胞培养、纯化、制剂以及储存过程中都有可能发生，是溶液形式的治疗用抗体发生降解的主要方式。人IgG1Fc段包含两个高度保守的蛋氨酸残基:CH2结构域末端的M和CH3结构域的M，均位于CH2-CH3界面，与多种配体结合位点非常靠近，因而在该残基发生的氧化作用使得抗体与proteinA，proteinG以及FcＲn的结合能力明显下降，抗体与FcγＲⅡa的亲和力略有下降。此外，Wang等也发现蛋氨酸氧化还会导致体内半衰期的显著下降。同时也有报道指出，在某些情况下，氧化作用可能诱导聚体形成而引起一定的免疫原性］。
四分子大小异质性
4.1聚集蛋白聚集是在发酵、纯化、制剂以及储存等各个制造过程中都普遍存在的问题，其对于抗体的质量、安全性和有效性都具有重要影响。考虑到聚集体对于生物制品生物活性的作用，原料药及药物制剂产品中聚集体的水平是评估分子质量属性的关键因素。众所周知，蛋白仅在折叠状态临界稳定，而大多数蛋白分子在被展开或部分展开的状态下具有形成聚集体的倾向，此时蛋白的高级结构被破坏，由此蛋白的疏水区域继而暴露，促进了分子间相互作用，从而易于发生聚集作用甚而引起随后的沉淀现象。聚体形成初期可以小的二聚体或片段存在，然后逐渐发展为更大的结构，例如亚可见或可见颗粒。聚集体的分子大小，结构以及可溶性决定了其对抗体生物学活性的影响程度。
聚体的存在会大大增加抗体的免疫原性，从而对抗体的安全性和有效性造成影响。蛋白聚集体在体内易引起免疫反应，直接导致一系列临床不良反应的发生，包括产生抑制药物治疗效应的中和性抗体(ADA);甚至与内源性蛋白发生交叉反应，造成严重的过敏性反应。
4.2片段通过分子筛分析加速试验后的抗体样品经常能发现抗体片段化现象。考虑到其可有效评估蛋白的纯度和完整性，单克隆抗体的片段化是亟需